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什么是DNA瓊脂糖凝膠電泳?
  • 發(fā)布日期:2023-05-29      瀏覽次數(shù):1441
    • 1、什么是電泳?

      電泳是一種利用電流根據(jù)DNA、RNA或蛋白質(zhì)的物理特性(如大小和電荷)來分離它們的技術(shù)。


      2、什么是瓊脂糖凝膠電泳?

      瓊脂糖凝膠電泳是一種電泳形式,用于根據(jù)核酸(DNA或RNA)片段的大小進(jìn)行分離。當(dāng)施加電流時(shí),帶負(fù)電的DNA/RNA通過瓊脂糖凝膠的孔隙向凝膠帶正電的一端遷移,較小的片段遷移較快。由此產(chǎn)生的條帶可以用紫外線(UV)光來觀察。

      然而,RNA往往會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),而且有時(shí)同一個(gè)片段會(huì)有多個(gè)不同的種類,這會(huì)影響其遷移的方式。因此,觀察到的條帶并不總是代表它們的真實(shí)尺寸,圖像也很模糊。

      在這種情況下,瓊脂糖天然凝膠(條件不會(huì)破壞分析物的自然結(jié)構(gòu))往往不用于分析RNA的大小,盡管它們可以提供數(shù)量和完整性的估計(jì)。替代方法包括RNA印跡法和變性瓊脂糖凝膠電泳,它們使用的條件能夠破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)。

      瓊脂糖凝膠也可用于根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和電荷來分離蛋白質(zhì)(與DNA/RNA不同,蛋白質(zhì)電荷根據(jù)所含氨基酸的不同而不同)。然而,由于瓊脂糖凝膠的孔徑較大,蛋白質(zhì)通常在聚丙烯酰胺凝膠上分離,而聚丙烯酰胺凝膠的孔徑較小,為小的蛋白質(zhì)分子提供更大的分辨率。

      因此,在本文的剩余部分,我們將重點(diǎn)討論DNA瓊脂糖凝膠電泳。


      3、凝膠電泳是如何工作的?

      瓊脂糖是瓊脂的一種成分,它形成了一個(gè)由螺旋狀的瓊脂糖分子組成的三維凝膠基質(zhì),這些螺旋狀的瓊脂糖分子在超線圈束中被氫鍵固定,有通道和孔隙,分子能夠通過。當(dāng)加熱時(shí),這些氫鍵斷裂,使瓊脂糖變成液體,并允許它在復(fù)位前被倒入模具。

      瓊脂糖在凝膠中的百分比影響了孔的大小,從而影響了可能通過的分子的大小以及通過的速度。瓊脂糖的百分比越高,孔徑越小,因此能夠通過的分子越小,遷移速度越慢。

      在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中,0.7~1%的瓊脂糖凝膠通常用于日常的DNA分離,對(duì)0.2~10kb范圍內(nèi)的片段提供良好、清晰的區(qū)分。較大的片段可以用較低百分比的凝膠來解決,但它們會(huì)變得非常脆弱且難以處理,而較高百分比的凝膠會(huì)對(duì)小片段提供更好的分辨率,但很脆且可能凝固不均勻。

      由于DNA在肉眼中是不可見的,在凝固過程中,一種夾層染料如溴化乙錠(EtBr)被納入凝膠中。這與DNA結(jié)合,并在紫外線下發(fā)出熒光,從而使DNA片段可以被觀察到。存在的DNA越多,條帶就越亮。

      與加載染料混合的樣本被放置在凝膠的一端,凝膠被浸泡在運(yùn)行緩沖液中。然后電流通過凝膠槽兩端的電極穿過凝膠。

      當(dāng)樣品運(yùn)行得足夠遠(yuǎn)以獲得足夠的分離時(shí),將凝膠從槽中取出并放在一個(gè)紫外光箱上。然后,夾層染料可以使樣品條帶可視化,并通過與已知條帶大小的DNA marker進(jìn)行比較來確定其大小。遷移距離和片段大小之間的關(guān)系是非線性的,增加了包括尺寸標(biāo)記作為指導(dǎo)的重要性。

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